Intervija ar projekta zinātnisko vadītāju Jeļenu Kirilovu un zinātnisko asistenti Ilzi Rubeniņu projektā “Jaunu luminiscentu savienojumu molekulārais dizains diagnostikas mērķiem”
Aktualizēts 24.05.2019 04:45
Daugavpils Universitātē apgūta jauna metode fluorescentā in situ hibridizācija, izmantojot sintezētas fluorescentās krāsvielas. Intervija ar projekta zinātnisko vadītāju Jeļenu Kirilovu un zinātnisko asistenti Ilzi Rubeniņu projektā “Jaunu luminiscentu savienojumu molekulārais dizains diagnostikas mērķiem”
Daugavpils Universitātē tiek realizēts projekts, kura ietvaros tiek sintezētas dažādas krāsvielas, kas tiek pielietotas dažādu organismu vizualizācijai. Jāpiebilst, ka šī projekta ietvaros Daugavpils Universitātē tika integrēta jauna metode – fluorescentā in situ hibridizācija, kas ir izplatīta dažādu slimību diagnostikā. Projekts apvieno pētniekus no dažādām zinātnes nozarēm kopīga mērķa sasniegšanai.
Pastāstiet, lūdzu, par fluorescento krāsvielu sintēzi, vai tas ir sarežģīts process?
J.K.: Tā kā mūsu pētāmās luminiscējošas krāsvielas pieder pie organiskām vielām, to iegūšanai var izmantot visas zināmas organiskās sintēzes metodes, tās iekļauj aizvietošanas, pievienošanas, reducēšanas/oksidēšanas un vairākas citas reakcijas. Visbiežāk mēs izmantojam halogēnu un ūdeņraža atomu aizvietošanas reakcijas un kondensēšanu ar dažādiem reaģentiem – amīdiem, dikarbonilsavienojumiem u. c. Jebkurš sintēzes process prasa piemeklēt labākus apstākļus, lai iegūtu iecerēto produktu ar vislielāko iznākumu un tīrību, dažreiz to var izdoties ātri un samēra viegli, dažreiz nepieciešams aprobēt vairākas pieejas lai sasniegtu mērķi.
Cik aptuveni laika aizņem sintezēt jaunu fluorescento krāsvielu un kā tiek veidoti krāsvielu nosaukumi?
J.K.: Ja sintēzes process sastāv no vienas stadijas, tad iegūšana un attīrīšana aizņem vismaz 2-3 dienas. Bet pārsvarā mūsu krāsvielu sintēzes ir vairākās stadijās: no 2 līdz 10. Jo vairāk sintēzes stadiju, jo ilgāku laiku prasa jauna luminofora iegūšana, tādēļ pilna sintēze ar visām iegūšanas, attīrīšanas un starpproduktu struktūras pierādīšanas etapiem var aizņemt līdz pusgadam. Jauniegūto vielu nosaukumu veidošanai pašlaik visas pasaules ķīmiķi izmanto mūsdienu organiskās ķīmijas nomenklatūru – IUPAC (starptautiskā teorētiskās un praktiskas ķīmijas savienība) noteikumus. Tā kā tādi nosaukumi vienmēr ir pietiekoši gari, mēs piešķiram un izmantojam sava starpā laboratorijā īsākus šifrus iegūtajiem savienojumiem.
Kādas ir raksturīgas iezīmes jūsu projekta ietvaros sintezētām krāsvielām?
J.K. Jauniegūtajiem luminoforiem ir ļoti plašs luminiscences spektrālais diapazons – tie izstaro gaismu no zaļas līdz sarkanai krāsai. Daudzi luminiscē ļoti spoži un maina luminiscences krāsu atkarībā no vides, kurā atrodas. Pie tam tās ir termo un fotostabilas krāsvielas kā bija noteikts mūsu pētījumos. Daži sintezētie luminofori spēj nokrāsot tādas bioloģisku materiālu iekšējas struktūras, kuras nevar saredzēt, krāsojot ar citām zināmām krāsvielām.
Vai diagnostikā bieži izmanto fluorescentās krāsvielas?
I.R.: Jā, diagnostikā tiek izmantotas fluorescentās krāsvielas un tās tiek izmantotas samērā bieži. Biologiem fluorescentās krāsvielas ir zināmas jau vairākus desmitus gadu, pētot dažādas nukleīnskābes, proteīnus un antigēnus. Medicīnā fluorescentās krāsvielas tiek izmantotas audzēju šūnu noteikšanai. Mūsdienās zinātniekiem ir izdevies pat iekrāsot zāļu ceļu, kā tās nonāk līdz konkrētajām šūnām organismā.
Ko tieši nozīmē fluorescentā in situ hibridizācija un kāpēc šī metode tika izvēlēta?
I.R.: Fluorescentā in situ hibridizācija ir molekulārās citoģenētikas metode, kas ļauj diagnosticēt noteiktu DNS vai RNS sekvenci gan audos, gan atsevišķās šūnās. Hromosomas vislabāk ir redzamas kondensētā stāvoklī vienā no šūnu dalīšanās fāzēm, ko sauc par metafāzi, tāpēc pētījumos tiek izmantotas metafāzes hromosomas. FISH pamatā ir hibridizācija un fluorescentais signāls, kas parāda vai mūsu pētāmajā paraugā ir/nav meklētā pazīme (gēns). Paaugstinoties temperatūrai tiek pārrautas ūdeņraža saites, kas veido dubultspirāles DNS, rezultātā veidojas divas vienpavediena DNS. Piemēram, ja vēlamies noteikt X un Y hromosomas tiek izvēlētas konkrētas zondes, kas ir komplementāras mūsu DNS un zondes galos ir piesaistīts fluorescentais signāls. Samazinoties temperatūrai tiek atjaunotas ūdeņraža saites; DNS atgriežas savā pirmatnējā stāvoklī – dubultspirālē, tikai tagad DNS spirālē ir piesaistījušās zondes, kas iezīmēs X un Y hromosomas. Izmantojot FISH, var noteikt konkrētu gēnu vai hromosomu, tās sniedz informāciju par šūnu struktūru, hromosomu izmaiņām gan izmēros, gan skaitā. Turklāt, mēs plānojam pētīt dažādu organismu genomus, iekrāsojot šūnas ar izstrādātājam krāsvielām.
Vai ir starpība pētīt dzīvnieka šūnas un auga šūnas, izmantojot fluorescentās in situ hibridizācijas metodi?
I.R.: Jā, protams, pastāv atšķirības starp dzīvnieka un augu šūnas izpēti. Pirmkārt, augu un dzīvnieku šūnas uzbūvē ir atšķirības. Tas nozīmē, ka augu protokoli neder dzīvnieku šūnu paraugiem, turklāt dažādu sugu pārstāvjiem ir vajadzīgas dažādas protokola modifikācijas, piem., augstāka hibridizācijas temperatūra, paraugu fiksēšana utml. Izmantot FISH augu paraugiem ir daudz sarežģītāks uzdevums nekā dzīvnieku paraugiem, jo augiem ir mazs genoms, mazs hromosomu skaits un maz atkārtojāmas DNS salīdzinājumā ar dzīvnieku šūnu.
Kādi organismi tiek izmantoti FISH pētījumos?
I.R.: Kā jau iepriekš minējām, tad, izmantojot FISH, tiek pētītas gan augu, gan dzīvnieku šūnas. Pētījumos tiek meklētas vēžu un dažādu audzēju šūnas. FISH metodi var pielietot pētījumos ar vienšūņu organismiem, piemēram, noteikt baktēriju klātbūtni Acanthamoeba organismā. Mūsu projekta ietvaros mēģināsim noteikt X un Y hromosomas kallusu šūnās, parazītos un komerciālo krāsvielu vietā izmantot mūsu sintezētās krāsvielas.
Cik ilgs laiks ir vajadzīgs viena parauga sagatavošanai?
I.R.: Viena parauga sagatavošanai ir vajadzīgas divas dienas. Visvairāk laika tiek patērēts tieši hibridizācijas procesam, jo tas prasa vairākas stundas. Diemžēl, sava darba augļus varam redzēt tikai tad, kas paraugs tiek skatīts ar mikroskopu un ne vienmēr tiek iegūts rezultāts, kas norāda uz to, ka hibridizācija nav notikusi un darbs jāsāk no jauna, meklējot iemeslu tam, kāpēc zonde nav piesaistījusies DNS.
Pētījumi notiek darbības programmas „Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa „Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.1. pasākuma „Praktiskas ievirzes pētījumi” Eiropas Reģionālā attīstības fonda līdzfinansētā projekta „Jaunu luminiscentu savienojumu molekulārais dizains diagnostikas mērķiem”, vienošanās Nr. 1.1.1.1/16/A/211, ietvaros.